في علم الأحياء الجزيئي ، يمكن للاختيار الجيد والتحضير لخطوات مختلفة لعزل الحمض النووي أن يكون الفرق بين الانتقال إلى تعبير البروتين أو فتح مجموعة أخرى مكملة الإعدادية للبدء من جديد. على الرغم من الأهمية الحاسمة لهذه الوصفات ، فإن الوصفات العازلة غالباً ما تكون مجرد وصفات مكتوبة بدون تفسير أو مبرر لمكونات مختلفة. أحد هذه العازلة هو الجلوكوز-تريس- EDTA أو العازلة GTE.
$config[code] not foundما هو GTE المستخدمة؟
يستخدم GTE لإعادة تعليق حبيبات الخلايا البكتيرية قبل lysing (كسر فتح) الخلايا وحصاد الحمض النووي البلازميد داخل. غالبا ما يضاف Lysozyme ، الذي يخفف أغشية الخلايا ، جنبا إلى جنب مع العازلة GTE. إن الحصول على تعليق متجانس لخلايا كاملة خلال هذه الخطوة بحيث يصبح حل التحلل المضاف في وقت لاحق يمكن أن يصل إلى جميع الخلايا هو المفتاح للحصول على غلة جيدة من الحمض النووي. تم تصميم GTE للقيام بذلك مع توفير بيئة مستقرة للحمض النووي.
الجلوكوز من أجل الأسمولية
يضاف سكر الجلوكوز 50 ملليجرام (ملليجرام) إلى عازلة GTE للحفاظ على الأسمولية حيث يكون تركيز المذاب خارج الخلايا قريبًا من ذلك الموجود داخل الخلايا. هذا يمنع تحلل الخلايا السابق لأوانه ، والذي يمكن أن يسبب انخفاض إنتاجية الحمض النووي بسبب التجميع والتدهور. المكونات الأخرى من المخزن المؤقت تساهم أيضا في osmolarity من الحل ، ولكن الجلوكوز ، كونه غير بالكهرباء ، هو خيار جيد لأنه لا يتداخل مع خصائص المخزن المؤقت للحل.
تريس لاستقرار درجة الحموضة
تريس هو الاسم المختصر لتريوس (hydroxymethyl) aminomethane ، وهو عبارة عن عازل هيدروجيني شائع جداً. في حالة العازلة GTE ، يضاف الملح الحمضي (Tris-HCl) إلى المخزن المؤقت بتركيز 25 ملي. هذا يحافظ على الرقم الهيدروجيني للمحلول في 8 القريب من الفسيولوجية ، وهو الرقم الهيدروجيني المثالي لمنع التحلل الحمضي (تدهور) من الحمض النووي البلازميد وردود الفعل الجانبية غير المرغوب فيها من مكونات الخلية الأخرى.
EDTA يمنع تدهور الحمض النووي
EDTA ، أو حمض ethylenediaminetetraacetic ، يلتقط أو "مخلب" أيونات المعادن من الحل ، ومنعهم من المشاركة في ردود فعل جانبية غير مرغوب فيها. في المخزن المؤقت GTE ، يتم إضافة EDTA في 10mM. والغرض الأساسي منه هو أن يحبس الزنك والمغنيسيوم والكالسيوم مجاناً ، وبالتالي يمنع تدهور الحمض النووي بواسطة مسارات معينة تتطلب تلك المعادن.
بعض النصائح الهامة
احتفظ بوقود جزيء الـ (GTE) على البارد واجعله بكميات صغيرة لمنع نمو البكتيريا غير المقصودة فيه. السكر ودرجة الحموضة تسيطر عليها جعل لوسط نمو كبير. استخدم دائمًا الماء النقي. يمكن أن تحتوي مياه الصنبور على فائض من أيونات المعادن من الأنابيب ، والتي يمكن أن تطغى على قدرة EDTA على التقاطها. إذا كنت تشك بوجود RNA متداخلة في عينتك ، قم بإضافة RNase A عند 100 ميكروغرام في المليلتر الواحد إلى المخزن المؤقت لـ GTE للقضاء على المشكلة.
